vsv-g因其嗜性广泛，转导效率高等优势成为ex vivo CAR-T中最成熟的包膜蛋白假性，并因此积累了较多CMC以及安全性经验，也成为当前IN VIVO CAR-T开发的热门选择，但从体外转到体内，vsv-g假性慢病毒开始面临新的问题：

vsv-g易被人类血清灭活，直接输注入体稳定性差。

vsv-g通过结合LDL-R实现与靶细胞的膜融合，但LDL-R在人体内广泛分布，这种广泛嗜性会带来较高的脱靶风险；

为了解决上述问题，Interius进行了如下探索：

•　引入已有报道的氨基酸替换（T214N和T352A），增强vsv-g血清和热稳定性。

•　对vsv-g进行特定位点突变，只保留融合特性而去掉与LDL-R的结合特性。

既往研究发现，特定氨基酸突变（如K47Q）能阻断VSV-G与其天然受体低密度脂蛋白受体（LDL-R）的结合，同时保持其膜融合活性。为筛选更多可能使VSV-G对LDL-R"失明"的突变位点，通过计算机模拟分析了野生型VSV-G与LDL-R复合物的晶体结构，重点探查靠近LDL-R带电残基的VSV-G氨基酸位点。

除已报道的致盲突变外，该方法还鉴定出Q10与I182两个候选位点：Q10正对LDL-R富含半胱氨酸结构域（CR3）中的R103，而I182则朝向驱动大部分结合作用的带负电残基D110与D112。研究者推测在这些位点引入相反电荷（如Q10K或I182E）将破坏VSV-G与LDL-R的结合稳定性。

突变载体转导CD7+ SupT1细胞的试验显示，Q10位点替换未能有效阻断VSV-G功能，载I182位点带电替换（I182D和I182E）均能有效解除VSV-G靶向性。最终选择单氨基酸替换I182E用于解除靶向，因其在高载体颗粒投入量时比I182D产生更少的非依赖结合分子转导现象。

这种结合了I182E、T214N和T352A替换的优化融合蛋白，被命名为第二代改进型（Gen 2.1）融合蛋白

该结合分子的初代设计为抗CD7单链可变区片段（scFv），通过人源CD28跨膜区锚定于载体囊膜表面，并经由人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）gp41蛋白的囊膜掺入基序连接免疫球蛋白G亚类1（IgG1）Fc"茎秆"结构。但后续发现其既能转导CD7阳性细胞，也能转导部分CD7阴性B细胞系，这表明结合分子组分与靶区细胞之间存在scFv元件之外的相互作用。

为降低fc受体介导的转导风险，interius在优化版结合分子茎秆结构中引入了多重突变，以消除Fc介导的效应功能，并证实该设计可将GFP载体转导限制于CD7阳性细胞（SupT1细胞及人外周血单个核细胞[PBMCs]），而对所评估的B细胞系未检测到转导活性。

通过多种不同靶向分子靶向多种表面抗原的binder，以实现对特定细胞的定向结合。为展示这种灵活性，研究团队采用靶向CD7、CD4或CD8的单链抗体（scFv）binder对载体进行假型化处理。使用CD4和CD8结合剂制备的载体分别选择性转导了CD4+和CD8+细胞，而基于CD7 scFv的结合剂则转导了CD7+细胞（该群体同时包含CD4+和CD8+T细胞）。

为验证引导载体转导的结合剂类型的灵活性，研究团队将CD4 binder分别构建为单链抗体（scFv）、重链可变区（VHH）和设计的锚蛋白重复蛋白（DARpin）形式用于PBMCs转导，这些不同构型均能实现类似的抗原特异性转导功能。这种特异性在三位受试供体中均保持稳定。

用INT2104处理活化的人外周血单个核细胞（PBMCs）后，成功转导了CD4+、CD8+T细胞及NK细胞。转导效率与体外CAR-T细胞制品生产过程中的水平相当。经INT2104转导的人PBMCs对B细胞系显示出剂量依赖性高效杀伤作用。

建立Raji B细胞肿瘤负荷鼠模型，然后通过尾静脉注射静脉给药。

采用高剂量INT2104（1×10⁷ TU/只）治疗的15只小鼠中，来自三位供体的所有动物均在治疗后第22天完全清除肿瘤，而移植活化PBMC的对照组小鼠则未出现肿瘤消退。

低剂量组（6×10⁵ TU/只）的五只小鼠也最终清除了肿瘤，但清除速度慢于高剂量组，所有肿瘤在第26天被完全消除。

通过流式细胞术对每周采集的血液样本进行CAR+细胞检测，高剂量组小鼠外周血中自第14天起可检测到CAR+细胞，该时间点与B细胞耗竭现象同步出现。低剂量组五只小鼠中仅有两只能检测到可定量的循环CAR+细胞。

INT2104治疗耐受性良好，所有接受治疗的小鼠均存活至研究预设时限，且未出现与载体输注相关的体重减轻事件。

在证实人源化小鼠静脉注射INT2104能产生功能性CAR+细胞后，研究团队采用食蟹猴模型进一步评估大动物模型中的靶向特异性。

作为临床候选药物的INT2104采用野生型人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）gag-pol质粒生产，而食蟹猴存在针对HIV的宿主细胞限制因子（如TRIM5α32,33），因次研究使用嵌合HIV/SIV gag-pol（xHIV）制备了替代载体用于NHP实验。该INT2104替代载体仅在编码衣壳的gag区域与INT2104存在差异，但保留了相同的第二代Fusogen、CD7结合域及CAR20转基因。

为评估大动物模型中T细胞与NK细胞的靶向转导潜力，研究人员在第0天给两只成年食蟹猴静脉输注了2×10⁹TU的INT2104替代载体（约3.5×10⁸ TU/kg）。在预定解剖日（给药后第4天）前对受试动物进行为期4天的监测，并与未经处理的雄性对照动物进行比较。在计划解剖时（给药后第4天）观察到B细胞耗竭现象，两只接受治疗的NHP外周血CD20+B细胞均减少50%以上（V690号动物减少84%，V745号动物减少53%）。

通过ddPCR技术，在第4天检测外周血单个核细胞（PBMCs）、骨髓单个核细胞（BMMCs）及脾脏、肝脏、肺脏等组织中前病毒DNA基因组，完成生物分布评估。生物分布分析显示，在计划性尸检第4天，已知含有CD7+细胞的脾脏、肝脏、外周血单个核细胞、骨髓和肺脏组织中前病毒DNA水平最高。

基于该生物分布分析结果，研究人员采用免疫荧光组织学方法探究肝脏、脾脏和肺脏中哪些细胞表达CAR蛋白，研究发现与载体靶向CD7+细胞的特性一致，CAR20蛋白仅见于T细胞和NK细胞。在两只经载体处理的非人灵长类动物脾脏和肝脏中，均检测到表达CAR的T细胞（定义为CD3+）。两只受试动物的脾脏中也检测到表达CAR蛋白的NK细胞（定义为NKG2A+），但在肝脏切片中未发现NK细胞。值得注意的是，肝脏中未检测到表达CAR蛋白的肝细胞（定义为HNF4α+）。脾脏中评估的B细胞（CD19+或CD20+）也未检出CAR+细胞。

巨噬细胞作为已知能吞噬颗粒物质的清道夫细胞，既往研究报道其可摄取慢病毒。本研究中，无论经处理的动物脾脏或肝脏中。与先前报告一致，通过RNAscope检测在治疗动物肝脏巨噬细胞中观察到慢病毒颗粒摄取迹象。两只载体处理的非人灵长类动物肺部切片中均未检测到表达CAR蛋白的细胞。在载体给药后第4天进行尸检前，两只载体处理动物均未出现载体相关毒性或安全性信号。

这些生物分布数据表明：采用CD7 Binder与Gen 2.1 Fusogen组合对INT2104进行假型化后，能实现静脉给药后对T细胞和NK细胞的特异性靶向。